本发明提供了一种重组蛋白酶K的纯化方法，包括以下步骤：往重组蛋白酶K发酵液中加入缓冲液A，混匀后一次超滤，获得已去除金属离子和分子量小于20KDa杂蛋白的超滤液；将步骤S1中得到的超滤液泵入用缓冲液A平衡的离子亲和层析胶中，层析胶放置于纯化桶中，后续搅拌便于层析胶和蛋白酶k结合，随后沉降，蠕动泵去除上清液，随后用缓冲液A复平衡后用静置，再用蠕动泵去除上清，加入缓冲液B搅拌沉降，蠕动泵去除上清，再加入缓冲液C，搅拌沉降，蠕动泵去除上清，再用缓冲液D洗脱，收集洗脱液；往洗脱液中加入缓冲液E，混匀后二次超滤，即可。本发明提供的重组蛋白酶K的纯化方法，纯化速度迅速；且对设备要求低，能耗低。