本发明涉及一种海洋微生物蛋白质的预处理方法，本发明通过超声裂解破碎微生物，盐酸胍和离子液体从海洋微生物中提取出蛋白质，加入蛋白质还原剂在高温条件下使蛋白质快速变性，加入可与蛋白质巯基快速反应的固相烷基化试剂，该试剂可选择性与蛋白质上的巯基反应，离心后，反复清洗固相颗粒表面去除其它干扰小分子，即杂质(如糖、盐、表面活性剂、脂类等)，获得高纯度的蛋白质，最后加入蛋白酶将海洋微生物蛋白质酶解成肽段后，离心后获得的产物经简单处理后可直接采用液相色谱‑质谱系统进行分析。该方法特别适合细胞壁较厚破壁困难，脂质等小分子干扰严重的海洋单一、混合微生物以及实际站位海洋宏蛋白质组样品的预处理。