本发明涉及一种规模化提取和纯化天然萤火虫荧光素酶的方法，属生物技术领域。本发明在低温条件下取天然萤火虫虫尾，通过添加酶提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；再通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换法，可以去除99％的本底，提高荧光素酶的发光比活力50倍以上；进一步经一次分子排阻层析、亲和层析和二次分子排阻层析，即可得到高纯度的荧光素酶，其活力和本底之比可提高到5690倍。本发明解决了一般纯化方法很难达到在去除本底的同时又保持萤光素酶活力的缺陷，提供了一种从天然萤火虫中制备高活力低成本的荧光素酶的方法，适用于规模化生产高活力荧光素酶。