本发明涉及一种临床治疗药物血药浓度监测用稳定同位素标记甲氨蝶呤内标试剂的制备方法，属于临床治疗药物血药浓度监测用标准物质研发领域。本发明以稳定同位素标记对甲苯磺酸甲酯为原料，经加成、缩合、水解，最后分离纯化得到稳定同位素标记甲氨蝶呤。本发明工艺路线具有合成所需原料简单易得、反应条件温和、不使用剧毒甲基化试剂、最终产物总收率高且易分离提纯。最终产物稳定同位素标记甲氨蝶呤的化学纯度可达99％以上，同位素丰度可达99％以上。本制备方法所制得的稳定同位素标记甲氨蝶呤内标试剂能满足临床治疗药物血药浓度监测用液相色谱串联质谱法所需稳定同位素标记内标试剂的技术要求。