本发明涉及食用菌培养技术领域，公开一种食用菌斜面菌种分割器，包括操作手柄、连接部件和切割部件，切割部件通过操作手柄伸入试管对母种分割；切割部件包括多个第一方向并排且均匀分布的割刀，各割刀第二方向上具有延伸距离，各割刀第三方向上一端与连接部件连接，第三方向上背离连接部件的一端能够插入母种内；操作手柄与连接部件具有第一连接状态和第二连接状态；第一连接状态下，操作手柄长度方向沿第一方向，第二连接状态下，操作手柄长度方向沿第二方向；第一方向、第二方向和第三方向两两垂直；本发明提供的食用菌斜面菌种分割器将食用菌母种分割成大小一致的菌种块，便于转接，提升后期转接培养的一致性；本发明还提供了其使用方法。