本发明涉及活体荧光成像领域，具体涉及一种荧光图像伪彩增强方法、装置、设备及存储介质，所述方法包括：获取待处理荧光图像；基于所述待处理荧光图像中各像素点的像素值，计算得到所述待处理荧光图像对应的最优阈值；基于所述最优阈值与待处理荧光图像中所有像素点的像素均值，计算得到所述待处理荧光图像对应的荧光阈值；基于所述荧光阈值，对所述待处理荧光图像中各像素点进行伪彩映射，得到伪彩增强后的彩色图像。可更好地保留并提取出待处理荧光图像中的有效荧光信息，提高经伪彩增强得到的彩色图像质量。