一种稳定均一纳米孔的制备方法，将纳米孔单体与粒径均匀的脂质囊泡生理缓冲液悬浊液混合孵育，在脂质囊泡上形成均匀稳定的纳米孔前体；依次加入解锁剂使脂质囊泡上的纳米孔前体形成纳米孔，加入交联剂使形成的纳米孔结构更稳固，加入表面活性剂破坏脂质囊泡，使纳米孔进入水溶液，形成纳米孔与脂质的混合液；经分离纯化得到分子量一致、孔径均一、结构稳固的纳米孔。本发明得到的成孔蛋白能够在特制的脂质囊泡上形成预成孔复合物，再结合使用交联剂和表面活性剂使得纳米孔的结构更加稳固、成孔成功率更高。