本公开提供一种具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，包括：制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片；对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理；在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，待聚丙烯酰胺溶液凝固后，得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。本公开通过微接触印刷技术在聚丙烯酰胺凝胶基底上实现单细胞图案阵列，制作出表面具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底，该方法具备在单一装置中规则排列大量细胞的特点，制备简便易行，且一次成型，无需多余操作，为高通量单细胞力谱测试提供良好的基础。