本发明为二氧化钛富集‑在线酶切‑分步洗脱糖肽和磷酸化肽方法，通过一种在线酶切的方法，在二氧化钛材料上实现了糖肽和磷酸化肽的同时富集和顺序洗脱。该方法是将糖肽和磷酸化肽样品与二氧化钛材料特异性结合后，先不加入洗脱溶液对糖肽/磷酸化肽进行洗脱(两种修饰肽段容易出现在同一个洗脱馏分中、即同时被洗脱出)，直接加入糖苷酶和酶切溶液，即材料、样品、酶及酶切溶液同时存在的条件下‑在线切除糖肽(结合在材料上的)的糖链，再通过两种洗脱溶液，分别从材料上得到含去糖链糖肽的馏分、含磷酸化肽的馏分。在蛋白标准品和复杂生物样品(如鼠脑)中实现了糖肽和磷酸化肽的同时、高效、高选择性的分步富集。