本发明提供了一种用于含组氨酸肽段的富集与测序的新方法和试剂盒。该方法通过蛋白质的还原烷基化和胰蛋白酶酶切、肽段N端氨基的修饰、组氨酸肽的色谱富集与质谱测序，对酶切肽段混合物中含组氨酸肽段进行蛋白质鉴定。利用本方法，大大降低了肽段混合物的复杂程度，显著提高了含组氨酸肽被质谱检出的机会及其在二级质谱中的裂解效率，使碎片离子的信噪比大大提高，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图实现对含组氨酸肽的从头测序。本发明还提供了用于该方法实施的试剂盒。